Znajdź zawartość

Błękitne rozbłyski to rodzaj bioluminescencji związanej z bruzdnicami. Biologom po raz pierwszy udało się opisać mechanizm tego zjawiska, które można obecnie obserwować w wodach przybrzeżnych Kalifornii. J. Woodland Hastings, jeden z członków zespołu badawczego i główny autor artykułu, który ukazał się w Proceedings of the National Academy of Sciences, już niemal 40 lat temu przekonywał, że u bruzdnic muszą występować bramkowane napięciem kanały protonowe. Jednak dopiero Susan Smith z Emory School of Medicine, Thomas DeCoursey z Rush University Medical Center i inni zdołali potwierdzić, że tak jest, identyfikując i testując u glonów geny, które przypominają geny kanałów zbadane wcześniej u ludzi, myszy oraz osłonic. Wg naukowców, świecenie pojawia się w wyniku następującego ciągu zdarzeń. Mechaniczne drażnienie przez wodę generuje impulsy elektryczne przepływające wokół wypełnionej protonami wakuoli (wodniczki). Impulsy doprowadzają do otwarcia bramkowanych napięciem kanałów protonowych, które łączą wakuolę z kieszeniami w błonie tych struktur komórkowych - scyntylonami. Protony docierające do scyntylonów aktywują tam lucyferazę (lucyferaza to enzym występujący u niektórych zwierząt, który po dodaniu związku zwanego lucyferyną oraz źródła energii chemicznej wytwarza błękitne światło). Stąd świecenie w czasie zakwitów bruzdnic.

Od jakiegoś czasu poszukuje się związków chemicznych wspomagających obrazowanie, które sprawdziłyby się w ramach monitoringu pacjentów zażywających heparynę, czyli lek zapobiegający krzepnięciu krwi. Wg Włochów, do tego celu świetnie nadaje się lucyferaza - enzym odpowiadający za świecenie robaczków świętojańskich (Bioconjugate Chemistry). Zespół Bruce'a Branchiniego wskazywał na potrzebę wynalezienia takich związków wspomagających obrazowanie, które emitowałyby promieniowanie w bliskiej podczerwieni. Głębiej penetruje ono tkankę, pozwalając lekarzom wykryć białka zaangażowane w krzepnięcie. Podczas testów naukowcy połączyli proteinę pozyskiwaną z lucyferazy świetlików z gatunku Photinis pyralis ze specjalnym fluorescencyjnym barwnikiem. Umożliwia on białku emitowanie promieniowania w bliskiej podczerwieni. Okazało się, że pozwala to wykryć niewielkie ilości aktywnego czynnika X (Xa). Inhibitory tego związku wykorzystuje się w zapobieganiu zdarzeniom zakrzepowo-zatorowym. Czynnik Xa bierze udział m.in. w aktywacji VIII czynnika krzepnięcia. Bioluminescencja i rezonansowe przeniesienie energii wzbudzenia bioluminescencji (ang. bioluminescence resonance energy transfer, BRET) to dwa naturalnie występujące zjawiska emisji promieniowania, które wykorzystano do różnych celów, np. obrazowania in vivo. Kluczowym elementem takich aplikacji jest lucyferaza, dająca żółtozielone światło. Opisywane technologie można ulepszyć, bazując na potencjale promienowania w bliskiej podczerwieni (nIR). Włosi zademonstrowali, że da się uzyskać emisję spektralną z maksimami 705 i 783 nm, wiążąc kowalencyjnie wariant lucyferazy z fluorescencyjnym barwnikami nIR. Akademicy zwracają uwagę na znaczenie wybiórczego znakowania fluorescencyjnymi barwnikami i skuteczność zapewnianą przez proces międzycząsteczkowego BRET. Włochom udało się też skonstruować wspomniane już wcześniej biotynylowane (oznakowane) białko fuzujące, czyli zlewające się, które emitowało promieniowanie w podczerwieni. Nowy materiał unieruchomiono na podłożu/macierzy zawierającej streptoawidynę - stosowaną w biotechnologii do oczyszczania białek - pokazując, że rozwiązanie można by uwzględnić w obrazowaniu z wykorzystaniem receptorów. To samo białko zastosowano do określenia aktywności czynnika Xa przy fizjologicznych stężeniach we krwi. W badanym układzie emisja w podczerwieni była możliwa tylko w sytuacji, kiedy cząsteczka lucyferazy była ściśle powiązana z barwnikiem fluorescencyjnym. Autorzy studium wykorzystali to zjawisko i połączyli obie te molekuły za pomocą krótkiego łańcucha aminokwasowego podatnego na trawienie przez czynnik Xa. W tej sytuacji aktywacja czynnika X powodowała nie tylko powstawanie skrzepu, ale też rozpad kompleksu lucyferazy z fluorochromem i tym samym spadek emisji nIR w próbce. Dokładny pomiar tempa tego zaniku pozwolił tym samym na ustalenie aktywności enzymatycznej czynnika Xa.

LIPS (ang. usta) - to akronim nazwy nowoczesnej techniki badawczej, która ma szansę otworzyć nowy rozdział w dziedzinie diagnostyki medycznej. Ze względu na swoją fenomenalną wręcz czułość oraz znikomy odsetek błedów istnieje szansa, że ta nowatorska metoda stanie się w niedalekiej przyszłości standardem stosowanym do wykonania testów, w których wiarygodność wyniku oraz zdolność do wykrycia minimalnych ilości przeciwciał jest kluczowym zadaniem. O szczegółach swojego pomysłu opowiedzieli na łamach czasopisma Biochemical and Biophysical Research Communications jego twórcy, Peter Burbelo i Michael Iadarola. Pełna nazwa techniki to Luciferase Immunoprecipitation Technology czyli "technologia immunoprecypitacji z użyciem lucyferazy". Lucyferaza to enzym wystepujący u niektórych zwierząt (w tym wypadku użyto jego odmiany pochodzącej od meduzy Renilla reniformis, lecz występuje on także np. u świetlika), który po dodaniu związku zwanego lucyferyną oraz źródła energii chemicznej wytwarza błękitne światło. Z kolei immunoprecypitacja jest to proces, w którym przeciwciała łączą się w wybiórczy sposób z określoną substancją chemiczną obecną w roztworze, a następnie tworzą wraz z nią nierozpuszczalny kompleks. O ile sama immunoprecypitacja nie jest techniką nową (stosowana jest rutynowo np. do testowania grup krwi), o tyle połączenie jej specyficzności z czułością osiągalną dzięki zastosowaniu lucyferazy daje ogromną poprawę jakości wyników. Jak dokładnie działa LIPS? W celu wykonania badania pobiera się od pacjenta próbkę krwi lub śliny, w której chcemy wykryć przeciwciała oraz zmierzyć ich stężenie. Następnie dodajemy do roztworu tzw. antygen (czyli substancję, na którą określony typ przeciwciał reaguje wiążąc ją ze sobą), który dzięki technikom inżynierii genetycznej połączony jest z cząsteczką lucyferazy. W tym momencie przeciwciała, o ile są obecne w próbce, zaczynają wiązać antygen i powodować wspomnianą wcześniej immunoprecypitację. Razem z antygenem z roztworu wytrąca się, oczywiście, związana z nim lucyferaza. Następnie całą objętość próbki przepłukuje się tak, aby usunąć wszystkie cząsteczki niezwiązane z przeciwciałami, tzn. wciąż unoszące się w roztworze (wytrącony osad wciąż pozostaje na dnie naczynia). Na samym końcu do pozostałego kompleksu dodaje się lucyferynę oraz źródło energii (pod postacią związku zwanego ATP) i odczytuje się jasność powstającego światła. Oprócz niezwykłej czułości LIPS posiada jeszcze jedną zaletę, zwaną liniowością. Oznacza to, że można precyzyjnie określić wynik w bardzo szerokiej skali, od bardzo niskich do bardzo wysokich stężeń. Przykładowo: stosowane dziś rutynowo techniki potrafią dać wiarygodny wynik w zakresie od 5000 do 15000 jednostek, tymczasem testy oparte o zastosowanie lucyferazy dają wynik w zakresie od zera aż do około miliona, a niejednokrotnie nawet więcej, jednostek. Największą wadą metody jest stosunkowo skomplikowany proces produkcji antygenów powiązanych z lucyferazą - można jednak liczyć, że w przypadku upowszechnienia się nowej techniki powstanie szeroki zakres odczynników niezbędnych do przeprowadzania testów w poszukiwaniu wielu różnych przeciwciał. Potencjalne zastosowania dla techniki, opracowanej na Uniwersytecie Georgetown przez dr. Petera Burbelo we współpracy z amerykańskim Narodowym Instytutem Zdrowia (NIH), są ogromne. Dzięki niezwykłej czułości testu możliwe będzie np. wykrywanie śladów infekcji wirusowej (w odpowiedzi na zakażenie pojawiają się w osoczu krwi przeciwciała), monitorowanie przebiegu chorób związanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem układu odpornościowego (np. stwardnienia rozsianego lub reumatoidalnego zapalenia stawów), a dzięki ewentualnej modyfikacji metody - także różnorodne inne testy w poszukiwaniu ściśle określonych substancji w dowolnego rodzaju próbce. Dotychczas badacze skupili się na udoskonaleniu LIPS na potrzeby diagnostyki w tzw. zespole Stiffa-Persona, ciężkim schorzeniu neurologicznym wynikającym z tzw. autoagresji, czyli niepożądanej reakcji układu immunologicznego na własne tkanki. Sami przyznają jednak, że w ramach eksperymentu wytworzyli odczynniki do wykrywania śladów dwudziestu trzech innych chorób. Jak mówi dr Burbelo, Teraz musimy tylko zebrać odpowiednią ilość danych i, miejmy nadzieję, przekształcić je w konkretne wyniki.